NatMedicine突破迄今为止最大的

前言

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种以进行性记忆力减退、认知功能下降和人格改变为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是老龄人口中发病率最高的疾病之一。

年4月13日，美国埃默里大学AllanI.Levey教授及其合作团队再次在国际专业学术期刊《NatureMedicine》(IF=30.)发表了最新研究成果，报道了迄今为止最大的阿兹海默症相关蛋白质组学研究。研究人员运用定量蛋白质组学技术、加权共表达网络分析、靶向蛋白质组技术（PRM）对健康人和阿兹海默症患者的2,多个人脑组织样本和近个脑脊液样本进行系统分析，研究确定了反映大脑生物过程的关键蛋白质共表达网络，为阿尔兹海默症的临床诊治提供了新的治疗靶标和生物标志物。

标题：Large-scaleproteomicanalysisofAlzheimer’sdiseasebrainandcerebrospinalfluidrevealsearlychangesinenergymetabolismassociatedwithmicrogliaandastrocyteactivation

研究对象：认知健康、正常衰老的个体、AD患者的脑组织和脑脊液

期刊：NatureMedicine

影响因子：30.

发表时间：年4月13日

研究背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease,AD）以β-淀粉样蛋白（amyloid-β,Aβ）过度沉积和Tau蛋白异常磷酸化为主要发病机理的神经变性疾病。然而对于AD病理生理学机制还不完全了解。

研究思路

文章亮点

1、样本珍贵：尸检脑组织样本；

2、大样本量：约2个组织样本和个脑脊液样本；

3、多种技术：LFQ、TMT定量蛋白质组学、PRM和SRM蛋白验证等；

4、多个中心：至少7个采样中心，BLSA，Banner，MSSB，ACT，Mayo，ROS/MAP，UPenn等；

5、多种组织类型：3种组织样本：FLPFC背外侧前额叶皮质、temporalcortex颞叶皮质、precuneus楔前叶，以及脑脊液CSF；

6、多种疾病类型：主要是AD的，还检测了其他神经退行性疾病，比如：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性伴TDP-43病理(FTLD-TDP)、进行性核上性瘫痪(PSP)、皮质基底部变性(CBD)、帕金森病和帕金森病痴呆(PD/PDD)和多系统萎缩(MSA)等。寻找AD致病最相关、以及最特异的区域/细胞/蛋白；

7、采用WGCNA分析，将几千个蛋白与临床相关指标进行关联分析，得到不同功能的蛋白模块集；

8、将大脑中不同细胞类型的marker基因跟不同模块集进行比对，从而形成细胞类型-蛋白模块-功能这样的关联集。（类似于单细胞测序的将marker基因跟细胞亚类和功能与疾病做关联）；

9、实验设计逻辑严密、故事性强。

研究内容

本研究使用定量蛋白质组和加权共表达网络分析对AD进行了迄今为止最大的蛋白质组学研究。从4个研究中心收集了44例巴尔的摩衰老纵向研究（BLSA）、例版纳太阳卫生研究所（BANNA）、例西奈山医学院（MSSB）和65例成人思维变化研究（ACT）非北侧前额叶皮质（DLPFC）组织，总共例对照、无症状AD(AsymAD)和AD。采用无标记定量（LFQ）对组织进行定量蛋白质组学分析，共鉴定到个蛋白。通过回归分析消除了年龄、性别和死后间隔（PMI）对蛋白质定量数据的影响，最终确定个蛋白利用加权相关网络分析算法构建蛋白共表达网络。加权基因共表达网络分析（WeightedGeneCo-ExpressionNetworkAnalysis，WGCNA）是一种适合进行多样本复杂数据分析的工具，通过计算基因/蛋白间表达关系，鉴定表达模式相似的基因/蛋白集合（module），解析module与样品表型之间的联系，绘制集合中基因/蛋白之间的调控网络并鉴定关键调控基因/蛋白。对鉴定到的个蛋白进行WGCNA共表达分析，将其分为13个模块。

研究结果

①构建AD共表达网络模块

为了评估这些共表达模块是否与AD相关，将模块蛋白表达水平与AD、淀粉样β斑块和神经纤维缠结的神经病理学特征相关联。观察到六个模块与所有病理、认知和功能测量显著相关：模块M1突触、模块M3线粒体、模块M4糖代谢、模块M5细胞外基质、模块M6细胞骨架和模块M10RNA结合/剪接。M4糖代谢模块显示出最强的AD性状相关性（认知r=-0.67，P=8.5×10-23；神经纤维缠结r=0.49，P=4.7×10-27；淀粉样β斑块r=0.46，P=1.3×10-23；功能r=0.52，P=2.6×10-12）。因为大脑中许多蛋白质共表达的改变可以由细胞类型的改变驱动，因此分析了每个共表达模块是否富含在特定的细胞类型中。同时为了将每个模块的细胞类型特性纳入其描述中，随后将那些细胞类型丰富的模块称为“M1突触/神经元”模块、“M2髓鞘/少突胶质细胞”模块、“M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢”模块和“M5内皮/微细胞外基质”模块。进一步研究表明在AD临床前期的病理过程中，M3线粒体和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的病例状态差异最大。

图1

无症状和有症状AD脑的蛋白质网络分析

（a）用WGCNA和差异丰度对对照组和AD患者（N=）脑组织蛋白水平分析；

（b）从四个独立的队列中测量的个蛋白质中产生了由13个蛋白质模块组成的蛋白质相关网络。

②ADnetwork与脑区、年龄、其他神经退行性疾病的关联性分析

进一步分析了这些共表达模块与不同脑区、年龄、其他神经退行性疾病的相关性，发现所有的模块都与颞叶皮层相关，12个模块与楔前叶相关。M1突触/神经元模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著降低，M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白随着年龄增加其表达水平显著升高。在FTLD-TDP和CBD病例中，M1突触/神经元和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白表现出显著变化。

图2

分析AD患者年龄与网络模块蛋白的相关性

（a）在不同年龄死亡的认知健康人群中测定DLPFC中的蛋白质水平，并用于分析AD蛋白质网络模块随年龄的变化；

（b）为每个AD网络模块创建一个合成的特征蛋白，并按年龄组测量，以及与老化脑队列中的年龄相关。显示了模块M1、M3、M4和M10的合成特征蛋白分析。

③采用PRM验证共表达网络模块蛋白的表达

为了进一步验证上述研究发现，采用PRM蛋白验证对个蛋白进行靶向验证，分析表明组学结果和PRM靶向验证结果具有很好的一致性。采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子，分析发现模块M2和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD疾病风险显著相关，表明这些蛋白共表达模块所反映的生物功能或过程可能在AD中起致病作用。鉴于M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与AD有很强的相关性，对该模块进行了更深入的研究。小胶质蛋白markers通过表达上调来响应淀粉样β斑块，表达下调来发挥抗炎症作用。

图3

M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块富含AD遗传危险因素和抗炎症相关小胶质细胞标志物

（a）采用GWASs分析AD模块蛋白是否为AD疾病相关的风险因子；

（b）AD蛋白网络模块中星形胶质细胞（顶部）和小胶质细胞（底部）表型标记的富集；

（c）模块M4中按模块特征蛋白相关值（kME）排列的前位蛋白的互作网络分析；

（d）AD小鼠模型中与M4模块中的蛋白质重叠的前30个差异最大的小胶质细胞的转录表达情况；

④M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白的表达水平在脑脊液中显著增加

为探讨M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块中的蛋白质是否可以作为AD体液样本的生物标记物，作者分析了两个队列的脑脊液（CSF）样本的TMT标记定量蛋白质组学。在队列1中，观察到22个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中CD44、PRDX1、DDAH2、LDHB和PKM蛋白显著差异性表达。在队列2中，27个蛋白映射到M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。其中17个蛋白与队列1中重合，且在AD-CSF中表现出相同的表达趋势，在AsymAD患者的CD44、LDHB和PKM也出现显著或趋势性升高，并与认知功能相关。

总之，M4节点蛋白CD44、PRDX1和DDAH2在AsymAD和AD患者中的表达显著升高。这些蛋白质也可能作为液体中的生物标志物，在疾病早期提示疾病存在。基于这些数据和分析，研究人员可以从中找出能够治疗和预防AD的新靶点，或是开发液体检测可用的生物标记物。

图4

M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白水平在AsymAD和AD-CSF中升高

（a）两组脑脊液M4蛋白的分析方法；

（b）测定相对蛋白水平；

研究结论

作者通过基于MS的蛋白质组学对2多个大脑和近个脑脊液样本的综合研究，提供了阿兹海默症的蛋白质网络变化和与疾病无症状和症状阶段相关的生物学变化，并强调了蛋白组学在疾病发病机理研究中的重要作用。针对这一生物学特性的项目有望用于阿兹海默症药物治疗和生物标记物开发，特别是针对促炎和抗炎星形胶质细胞和小胶质细胞的项目。

作者简介

AllanI.Levey博士，EmoryUniversity神经学系教授

AllanI.Levey博士是埃默里大学(EmoryUniversity)神经学系教授和系主任，也是埃默里老年痴呆症研究中心(EmoryAlzheimersDiseaseResearchCenter)主任。

Levey博士是国际公认的神经生物学专家，在神经退行性疾病方面做出了诸多原创性工作。他发表了多篇研究论文。他的工作有助于理解包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病的大脑系统和机制，并为新的治疗策略确定分子靶点。他获得多个奖项,包括DerekDenny-BrownNeurologicalScholarAward,HeikkilaResearchScholarAward及HealthAdvancementResearchAward。Levey博士还被评为ISI神经科学领域的高引用研究员，并一直被列为美国最好的医生之一。

参考文献

JohnsonECBetal.Large-scaleproteomicanalysisofAlzheimer’sdiseasebrainandcerebrospinalfluidrevealsearlychangesinenergymetabolismassociatedwithmicrogliaandastrocyteactivation.NatureMedicine.Apr13.doi:10./s---6

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