脊髓性肌萎缩症的三种基因诊断方法比较

本文原载于中华检验医学杂志年01期

脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种由于脊髓前角运动神经元退化引起的神经肌肉性疾病，新生儿中的发生率约为1/，为发病率仅次于囊性纤维化的常染色体隐性遗传疾病[1]。运动神经元存活(survivalmotorneuron,SMN)基因是SMA的主要致病基因，定位于染色体5q11.2-q13.3区域，该基因具有两个高度同源的拷贝SMN1和SMN2，两者仅有5个碱基的差异，分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中[2]。SMN1表达全长的有功能的SMN蛋白，SMN2由于第7外显子中c.位点的CT的碱基差异，表达的蛋白缺少由第7外显子编码的核心功能区，生成的转录产物易降解，仅能在SMA患儿缺失SMN1基因时，起剂量补偿作用[3]，因而，SMN1基因缺失或突变是SMA的主要病因。研究表明，约95%的SMA患者存在SMN1基因纯合缺失，直接对SMN1基因进行缺失检测是SMA分子诊断的首选策略[4]。

目前已报道的SMA基因诊断方法众多，不同方法的可靠性、操作难易度及经济性等指标均不尽相同。本研究分别采用多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)、聚合酶链式限制性片段长度多态性分析(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)及实时荧光定量PCR3种临床常用SMN1缺失变异检测方法对41例SMA疑似患者及份正常对照样本进行缺失变异分析，比较这3种方法对SMN1基因缺失改变的检测效果。

对象与方法

一、对象

选择年3月至年6月期间就诊于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的疑似SMA患者41例，在临床检查中这些患儿均表现出肌张力减退，肌电图呈神经源性损害，血清肌酸磷酸激酶水平正常或轻度升高，他们均来自无血缘关系的家庭，其中男24例，女17例，年龄8d～8岁。另选择与患者无血缘关系、无遗传病家族史的健康体检者名作为正常对照组。本研究通过上海儿童医学中心伦理审查委员会审查，所有患者均由其父母或监护人签署知情同意书。

二、方法

1．试剂与仪器：

QIAampBloodDNAMini基因组DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，SALSAMLPA的P-B2SMA试剂盒(荷兰MRC-Holland公司)，rTaq聚合酶等PCR试剂(天根生化科技北京有限公司)，C?ThermalCyclerPCR仪(美国Bio-Rad公司)，限制性内切酶DraⅠ和DdeⅠ(美国Promega公司)，SMN1基因外显子缺失检测试剂盒(荧光定量PCR法，上海五色石医学研究有限公司)，ABIStepOneplus型实时荧光PCR仪(美国ABI公司)。

2．基因组DNA抽提：

采集疑似患者及正常对照者静脉血各2ml，用QIAampBloodDNAMini试剂抽提待检者基因组DNA，按试剂说明书操作。使用微量核酸测定仪，对所提取标本DNA纯度进行检测，吸光度A/A的比值1.8～2.0。

3．荧光定量PCR检测：

荧光定量PCR检测采用上海五色石医学研究有限公司SMN1基因外显子缺失检测试剂盒进行。其采用DNA小沟结合探针实时多重荧光定量PCR的方法，使用人RPP40基因作为内标基因，分别对SMN1基因第7外显子和第8外显子进行扩增并对拷贝数进行相对定量检测，同时采用化学阻断的方法控制SMN2对定量结果的影响。荧光定量PCR检测按试剂盒标准程序操作，每批反应加入1个空白对照、1个缺失对照及3个梯度正常对照，使用ABIStepOneplus型实时荧光PCR仪进行反应后，实时收集目的基因(FAM)和内标基因(VIC)信号，通过待检标本与正常对照品3个梯度标本反应循环阈值差值(ΔCt)值的平均值比较，判断SMN1外显子缺失情况。

4．PCR-RFLP分析：

标本均进行SMN基因外显子7、8的PCR扩增及限制性内切酶酶切分析。SMN基因第7和8号外显子PCR引物序列分别为，上游引物：5′-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3′，下游引物：5′-CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT-3′；上游引物：5′-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3′，下游引物：5′-CTACAACACCCTTCTCACAG-3′。PCR反应体系均为15μl，含2×TagPCRMasterMix7.5μl、DNA模板(ng/μl)0.5μl、正反向引物(10μmol/L)各0.5μl、双蒸水6μl，反应条件为94℃2min；94℃30s，58℃45s，72℃60s，30个循环；72℃延伸7min。而后取第7和8号外显子PCR产物各9μl，分别加入0.5μlDraⅠ(10U/μl)和0.5μlDdeⅠ(10U/μl)、10×相应缓冲液1.5μl及4μl双蒸水，37℃水浴消化4h后行电泳分析产物。

5．MLPA分析：

MLPAP-B2SMA试剂盒共包含25对探针，分别对应SMN1和SMN2基因的第7和8号外显子及21对正常参照引物，MLPA检测按试剂盒标准程序操作。取5μl(终浓度为60ng/μl)DNA，98℃变性5min，降温至25℃后加入1.5μl多重探针及1.5μl缓冲液，95℃变性1min后60℃杂交18h，而后54℃加入32μlLigase-65连接酶混合物进行连接反应，孵育15min，98℃灭活连接酶5min。取10μl连接产物进行PCR扩增，反应体系为50μl：95℃30s，60℃30s，72℃60s，共反应35个循环，72℃20min延伸，25℃保存。取1μl扩增产物加入9μl去离子甲酰胺和LIZ混合，95℃变性5min，经GeneticAnalyzer测序仪(美国ABI公司)进行扩增片段分离、峰高和峰面积的检测，使用GeneMaker软件进行数据分析。以含2拷贝SMN1和SMN2的正常样品作为参照，分析每个待检样品的SMA相关探针的比值，根据试剂盒的说明推算SMN1基因和SMN2基因第7和第8外显子的拷贝数：拷贝数比值范围在0.45～0.70为1拷贝，0.70～1.30为2拷贝，1.30～1.55为3拷贝，若无峰信号则为片段缺失。

结果

一、荧光定量PCR结果

分别计算正常对照品外显子7、8反应中目的基因与内标基因间的ΔCt值，得到3个梯度正常对照品的ΔCt值的平均值。待测样本中，若满足以下任意一项，即为SMN1基因外显子缺失，其中外显子7反应：ΔCt值(正常对照品平均ΔCt值＋0.80)或FAM无信号；外显子8反应：ΔCt值(正常对照品平均ΔCt值＋1.50)或FAM无信号。在41份疑似患儿及份正常对照标本的荧光定量PCR检测中，结果显示疑似病例中29例患者存在SMN1纯合缺失，1例为杂合缺失携带者，正常对照中5例为杂合缺失，其余病例及对照均为未缺失。其中SMN1纯合缺失患者中，27例均为第7＋8外显子同时缺失，2例仅缺失7号外显子。

二、PCR-RFLP结果

正常个体SMN外显子7扩增产物经DraⅠ酶切后，出现bp(SMN1)及bp(SMN2被酶切片段)2条带，SMA患者存在SMN1基因的纯合缺失，则仅有bp条带；而正常对照组第8外显子PCR扩增产物经酶切后应具有、、68bp3条带，相应的SMA患者仅有、68bp2个条带。如图1所示为部分疑似SMA患者PCR-RFLP检测结果，其中2、5、16和17号标本第7和第8外显子扩增产物酶切后分别出现及bp条带及、、68bp条带，为正常个体，其余样本均缺失SMN1特异条带，为外显子7＋8纯合缺失。对本研究中例疑似患儿及正常对照酶切电泳结果进行分析，判断疑似患者中27例为外显子7＋8纯合缺失，2例为外显子7纯合缺失，其余疑似患者及正常对照组带型与正常个体一致，均未检测出缺失。

图1

部分疑似脊髓性肌萎缩症患者SMN1基因聚合酶链式限制性片段长度多态性分析检测结果

三、MLPA结果

MLPA检测结果显示，临床SMA疑似患者中，29例为外显子7＋8或外显子7的纯合缺失，1例为杂合缺失携带者，其余疑似病例SMN1基因外显子7和外显子8均为2拷贝，MLPA结果提示无缺失。

四、荧光定量PCR、PCR-RFLP及MLPA结果比较及结果分析

本研究分别采用实时荧光定量PCR、PCR-RFLP及MLPA3种临床常用SMN1缺失变异检测方法的对例SMA疑似患者及正常对照样本进行SMN1缺失变异分析。结果显示，无论对于纯合、杂合缺失，还是正常基因型，荧光定量PCR与MLPA结果完全一致，而对于PCR-RFLP方法，由于携带者具有杂合缺失SMN1基因，即含1条正常等位基因和1条缺失型等位基因，因此产生与正常人相同的酶切条带，所以其未能检测出疑似患者及正常对照组中的杂合缺失，见表1。

结合荧光定量PCR、PCR-RFLP及MLPA分析结果，将本研究病例结果总结可知：41例SMA疑似患者中，SMN1纯合缺失29例，疑似患者SMA基因诊断率为71%，另有一例存在杂合缺失。同时，29例纯合缺失患者中，第7外显子和第8外显子同时缺失的病例为27例，占纯合病例的93%，2例仅缺失第7外显子，占缺失总病例的7%。例正常对照样本中，5例为杂合缺失携带者，杂合缺失携带率为1∶72。

讨论

SMA是一组常见的常染色体隐性遗传病，其特征为脊髓前角运动神经元退行性变而引起的肌肉萎缩与瘫痪，临床主要表现为进行性、对称性肢体近端及躯干肌肉的无力和萎缩，该疾病危害严重且致死率高，给患者家庭带来极重的经济和精神负担。以往SMA的诊断主要依据临床病史、体征及肌电图和肌肉活检，这些不但存在较高误诊和漏诊的可能，同时如肌肉活检等SMA诊断的金标准，操作复杂且创伤性较大，很难保证疾病的及时、正确诊断[5]。

年SMN被克隆以来，SMA的分子诊断因具有确诊意义而受到重视[6]。SMN是SMA的主要致病基因，其有2个反向重复拷贝，端粒侧的称为SMN1，着丝粒侧的称为SMN2。研究表明，约95%的SMA患者存在SMN1基因纯合缺失，且大部分是外显子7、8同时缺失，少部分仅缺失外显子7，因而对SMN1基因外显子7和8的缺失检测是SMA基因诊断的一种简便、特异的方法，同时作为一种无创性检查，该方法易被患儿接受，是SMA鉴别诊断和临床确诊的重要辅助手段。目前已报道的SMN1缺失变异检测方法众多，实时荧光定量PCR、MLPA和PCR-RFLP是其中较常用的3种。

PCR-RFLP方法的建立是SMA分子诊断技术发展中的里程碑，其根据SMN1和SMN2基因第7、8外显子之间碱基差异所导致的限制性内切酶位点不同、酶切后电泳条带的位置变化判定SMN1基因是否存在缺失，方法简单易行，一直沿用至今[7]。本研究中，PCR-RFLP方法对SMN1基因第7、8外显子纯合缺失的检测与荧光定量PCR及MLPA结果完全一致，证明了该方法在SMN1基因纯合缺失检测中的可行性，但该方法却未能检测出杂合缺失，无法对SMA致病基因携带者进行诊断。研究表明，约5%～10%的SMA患儿表现为SMN1杂合缺失伴SMN1基因的点突变，这些携带复合杂合突变的患儿易在PCR-RFLP检测中被遗漏[8]。因而，能够判断SMN1拷贝数变异的检测技术成为当前SMA基因诊断的重点。

MLPA及荧光定量PCR技术均是较常用的基因拷贝数变异检测手段。其中，MLPA通过设计特异性探针，将杂交与扩增结合起来，检测基因缺失或重复的同时还可实现定量分析。荧光定量PCR技术则通过荧光基团，对PCR产物进行标记跟踪，对目标基因进行扩增的同时对拷贝数进行相对定量检测。本研究检测过程中，MLPA及荧光定量PCR对SMN1纯合缺失患者及杂合缺失携带者的诊断均一致，均具有较高准确性。检测缺失变异的同时，我们发现，第7和第8外显子同时缺失的病例比例非常高，仅少数为第7外显子缺失，外显子7较8有更高的缺失率，与以往文献报道一致[6]，则SMN1基因第7外显子可能与疾病的相关性更高。

荧光定量PCR与MLPA应用于SMA基因诊断，不仅可以检测纯合缺失变异，还可进行半定量分析，辨别携带者致病基因杂合缺失情况，实现携带者筛查。在份正常对照样本中，2种方法均检测出其中5例为杂合缺失，携带者频率为1∶72，在中国其他大规模携带者筛查研究中，SMN1杂合缺失携带者频率亦高达1∶63～1∶39不等[9,10,11]。作为第二大常染色体隐性遗传病，SMA携带者频率非常高，通过对杂合缺失携带者的检测来降低潜在的传递致病基因和生育SMA患儿的风险是降低SMA发病率的最有效途径[12]。

就SMA基因诊断技术应用现状而言，MLPA由于具有稳定的商品化解决方案，是当前较常用的SMN基因拷贝数分析方法[13,14]，但其操作步骤繁复、检测时间长、对技术人员操作及分析能力要求较高，这些易对检测结果的可靠性产生影响，同时MLPA检测试剂及分析耗材昂贵，较高的成本给其在SMA疾病分子诊断及人群筛查中的应用带来诸多挑战[15]。相对而言，荧光定量PCR检测平台更加普及，并可对每份样本检测结果进行实时监控和评价，结果判定方式更为直观，同时具有操作步骤少、成本低、无需开盖检测等诸多优势，在SMN基因拷贝数检测中愈加受到重视[16]，有研究表明其在SMA基因诊断中的特异度和敏感度分别达到了.0%及96.2%，准确性较高[3]。但以往该方法缺乏标准化程序，仪器规格和试剂选择等的多样性使部分结果重复性差，给该技术的广泛开展带来阻碍。本研究中的荧光定量PCR检测则应用了已建立成熟的SMN1基因缺失检测试剂盒，其对检测过程及结果解释的要求均较统一，避免了程序优化及试剂选择中可能引入的结果差异。从本研究的结果亦可看出，不论是纯合缺失的检测还是携带者的筛查，荧光定量PCR均具有较好的准确性和重复性，同时，尤其是在高检测通量及低投入价格等方面的优势使其比MLPA更适合于携带者的筛查。

综上所述，在SMA的疾病诊断中，SMN1基因外显子7和8的缺失检测是一种无创、特异的分子诊断方法。PCR-RFLP方法简便易行，对SMN1基因纯合缺失患者的诊断较可信，但其不能判断杂合缺失及携带者状态，无法用于携带者筛查，同时也可能漏检携带复合杂合突变的SMA患者。MLPA及荧光定量PCR均为高灵敏度的相对定量技术，不仅可以诊断SMN1纯合缺失，还可辨别携带者致病基因杂合缺失情况，其中MLPA方法特异准确，实施方案较成熟，但其对DNA样本质量要求极高，结果判读需要依赖经验，且相对而言价格较高。相较于这2种方法，荧光定量PCR检测周期短、通量大，结果直观易于判读，在进行缺失型SMA的分子诊断尤其是携带者筛查中具有较大优势。（参考文献：略）

本文编辑：武昱

更多精彩尽在中华检验医学杂志

转载请注明：http://www.iodky.com/wacs/1279.html