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好文推荐肌肉萎缩症治疗的研究进展
肌肉萎缩症治疗的研究进展
Researchprogressinthetreatmentofmusculardystrophy
马淑梅1,2,3，陈瑶1,2,3，刘莉1,2,3*
(中国医药工业研究总院上海医药工业研究院1.药理评价研究中心；2.创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海；3.上海市生物物质成药性评价专业技术服务平台，上海)
摘要：肌肉萎缩症是一组进行性骨骼肌细胞退化疾病，该病患者的骨骼肌再生反应无法满足肌细胞退化后修复过程的需求。其发病机制和诊断治疗研究近年取得了重大进展，但临床尚无成熟有效的治疗方法，基因治疗、干细胞治疗以及抗炎药物等治疗方案为肌肉萎缩症治疗的主要研究方向。本文简要综述肌肉萎缩症的治疗研究现状。
关键词：肌肉萎缩症；基因治疗；干细胞治疗；抗炎药物
以下内容为节选
肌肉萎缩症是一组进行性骨骼肌细胞退化疾病，主要有假肥大型肌肉萎缩、肢带型肌肉萎缩、面肩肱型肌肉萎缩、Emery-Dreifuss型肌肉萎缩、远端型肌肉萎缩、眼咽型肌肉萎缩等。正常的骨骼肌细胞具有健全的再生反应，可以生成新的肌纤维，而肌肉萎缩症患者的骨骼肌再生反应无法满足肌细胞退化后修复过程的需求[1]。肌肉萎缩症主要通过肌肉组织活检进行诊断，少数类型也可通过基因检测进行诊断。肌肉萎缩症的组织病理学特征为：肌纤维形态分布异常增大，细胞核聚集的细胞数目增多，脂肪和结缔组织取代肌纤维，肌纤维的质量明显减少，临床表现为肌无力。某些肌肉萎缩症会伴有心血管并发症。目前肌肉萎缩症尚无有效的治疗方法，基因治疗、干细胞治疗以及抗炎药物治疗等相关研究成为该病治疗的主要方向。本文简要综述肌肉萎缩症治疗的研究现状。
1基因治疗
1.1规律成簇间隔短回文重复基因编辑系统
肌肉萎缩症是一种由基因缺陷导致的罕见先天性疾病，由抗肌萎缩蛋白缺乏或功能受损而引起。抗肌萎缩蛋白由包含79个外显子的基因编码，如一个外显子出现突变，抗肌萎缩蛋白就无法产生，继而肌肉就会发生萎缩并逐渐恶化。Munshi等[2]采用
腺相关病毒的非致病性载体传递基因编辑系统规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9观察其对小鼠肌肉萎缩症的作用。CRISPR技术依赖于单链RNA引导的Cas9在基因组中的精确定位从而剪断DNA，随后通过连接受损的断链，或者利用DNA模板创造新序列以修复缺口。因成年人的成熟肌肉细胞通常是不分裂的，不具备开启添加或纠正基因所必需的DNA修复机制，故CRISPR尚无法用于已患有肌肉萎缩症患者的治疗。但CRISPR可用于删除出现突变的外显子，细胞的基因阅读机制可合成缩短的抗肌萎缩蛋白，该机制与外显子跳跃和微基因方法类似。Nelson等[3]用CRISPR删除出现突变的外显子23，机体进一步自动“缝合”其他的蛋白编码区域，制造出缩短但仍可发挥作用的新版本抗肌萎缩蛋白。该研究首先利用无致病性的腺相关病毒(AAV)做载体，将基因编辑系统输送到成年小鼠的腿部肌肉细胞内，结果显示，其腿部的抗肌萎缩蛋白水平得到一定程度的恢复，肌肉力量增加。该研究随后又将基因编辑系统注入小鼠血液，受试小鼠全身肌肉功能得到明显改善。此外，Long等[4]利用对肌肉具有高亲和力的AAV9将CRISPR/Cas9编辑元件注入肌肉萎缩症模型小鼠体内，研究表明，其基因编辑策略在小鼠卵子和精子细胞中可发挥作用，经生殖细胞改造后80%的小鼠子代都显示缺失23号外显子，从而促进试验动物中Dystrophin蛋白的表达。随后将该策略应用于与临床更相关的体细胞基因编辑，在小鼠出生几天后，通过腹部、肌肉或眼睛后部注射，利用AAV9将编辑系统传送到小鼠体内，比较各组Dystrophin蛋白水平，结果显示，直接肌肉注射组Dystrophin蛋白水平最高。Tabebordbar等[5]也利用CRISPR和AAV9删除23号外显子用于治疗罹患肌肉萎缩症的小鼠，结果显示小鼠获得类似的肌肉修复功能。该研究利用荧光标记物分析了基因编辑系统对远离注射位点卫星细胞的影响，结果发现部分卫星肌管已恢复表达Dystrophin，提示AAV-CRISPR或许可在体内提供持续的遗传修复。该研究表明运用CRISPR基因编辑技术可治疗成年哺乳动物的基因疾病，这种治疗方法也有望应用于临床肌肉萎缩症患者的治疗。
1.2腺相关病毒
多种疾病的死亡原因是由于心肌缺失导致的心脏萎缩进而引发心衰，其中引发肌肉萎缩的激素尤其是肌肉生长抑制素分布广泛，且发挥着重要作用。Winbanks等[6]利用AAV特异性靶向作用于心肌和骨骼肌，该方法可仅在肌肉中阻断肌肉生长抑制素，该类AAV可通过将Smad7信号蛋白运输至肌肉细胞中，阻断肌肉生长抑制素受体Smad2和Smad3，从而阻断肌肉萎缩。
1.3外显子跳跃疗法
医学界普遍认为肌肉萎缩症是由编码Dystrophin的基因突变引起的，编码Dystrophin的基因定位于Xp21.1-p21.3，是迄今为止发现的最大的人类基因，由79个内显子组成。在正常肌肉中，该基因位于肌肉纤维细胞的细胞膜附近，通过α-dystroglycan把肌肉细胞内的细胞骨架与细胞外的基质连接起来，使肌肉发挥正常功能[7]。当基因缺失、重复或发生移码突变时，蛋白结构即会发生较大变化，无法形成有功能的Dystrophin蛋白。抗肌萎缩蛋白基因缺失或突变有移码突变和整码突变两种类型，移码突变破坏的开放阅读框导致重要的抗肌萎缩蛋白无法产生，细胞膜结构破坏从而导致肌细胞坏死，引发肌肉萎缩症；整码缺失破坏的开放阅读框，可产生缩短的但仍具有一定功能的抗肌萎缩蛋白，可引发临床症状较轻的Becker型肌营养不良(BMD)。因此，采用外显子剪接技术将肌肉萎缩症患者的移码突变类型修改为整码突变类型，即有可能将症状较重的肌肉萎缩症转变为症状较轻的BMD。
2干细胞治疗
2.1肌肉干细胞
肌肉萎缩症可直接影响肌肉干细胞，以往认为Dystrophin是只存在于肌纤维的结构蛋白，但Rudnicki等[8]的研究发现，肌肉干细胞也可表达Dystrophin蛋白。肌肉干细胞负责在肌肉损伤后进行修复，生成肌纤维的前体细胞。在缺乏Dystrophin的情况下肌肉干细胞生成的前体细胞减少，最终形成的功能性肌纤维也很少。Dystrophin是肌肉干细胞感知自身在周围组织中定向的关键因素。而肌肉干细胞需要通过感知环境决定进行自我更新或分化，缺少这类信息肌肉干细胞就无法正确分裂，也无法正确修复肌肉损伤。
2.2沉默信息调节因子1
细胞代谢除可提供稳定的能量供应，还可影响表观基因组，改变基因表达。沉默信息调节因子1(Sirt1)属于Ⅲ类去乙酰化酶家族，可通过NAD+感受细胞能量代谢变化，并通过其去乙酰化酶活性影响底物的乙酰化水平，将代谢信号转化为表观遗传信号，影响细胞基因表达，了解这一过程对治疗肌肉萎缩症等肌肉相关疾病具有重要意义。Ryall等[9]发现，在骨骼肌干细胞中，NAD+依赖性去乙酰化酶Sirt1可感受代谢变化信号并通过其去乙酰化活性影响H4K16乙酰化修饰，启动肌肉基因表达转录。研究发现，在生长条件良好的培养环境中，处于静止期的骨骼肌干细胞代谢会经历从脂肪酸、丙酮酸氧化向糖酵解方向的转化，并且激活戊糖磷酸途径合成许多代谢小分子。同时，与激活的骨骼肌干细胞相比，静止期细胞中Sirt1的去乙酰化酶活性和NAD+水平更高，因此当静止期细胞代谢方向改变，细胞中NAD+水平下降，Sirt1的去乙酰化酶活性也随之降低，可导致组蛋白H4K16乙酰化水平升高，从而启动骨骼肌分化相关基因的表达。该研究通过建立骨骼肌细胞特异性敲除sirt1基因的小鼠模型，发现sirt1功能缺失可导致基因敲除小鼠的骨骼肌细胞出现纺锤样瘦长形态，说明基因敲除小鼠体内骨骼肌细胞同样出现了过早分化。
2.3移植干细胞
微小核糖核酸(miRNA)是一类不编码蛋白质的单链核糖核酸分子，主要参与控制基因表达。Sato等[10]发现两种能够促进骨骼肌再生的miRNA，分别为miR-和miR-，将携带miRNA的骨骼肌干细胞植入到肌肉萎缩症模型动物体内，可维持骨骼肌干细胞的修复能力，实现骨骼肌再生。该研究进一步将携带miRNA的骨骼肌干细胞移植到肌肉萎缩症模型小鼠腿部，发现其腿部的骨骼肌细胞开始增加，肌肉再生，但这种方法是否能够应用于人类骨骼肌细胞的再生仍有待研究，未来的研究方向可能集中于诱导多功能干细胞产生骨骼肌干细胞，从而用于治疗肌肉萎缩症。
3抗炎药物
抗肌萎缩蛋白作为桥接和锚定蛋白，其N-端与胞质内的肌动蛋白纤维相连，C-端通过β-抗肌萎缩蛋白聚糖与胞外基质相连[11]。骨骼肌细胞中抗肌萎缩蛋白缺失可激活一系列下游反应包括炎症、胞外基质降解、肌纤维慢性退化与再生以及间质纤维化等，上述反应加剧了肌萎缩的病程进展。研究表明抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物除作为分子支架发挥机械作用外，还发挥着重要的信号传递作用。抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物的其他组成成分缺失会造成严重的肌纤维膜机械不稳定性，导致骨骼肌细胞内一系列信号通路被激活，还可造成细胞胞膜稳定性下降，易被收缩-放松机械刺激损伤，从而促进细胞外钙离子内流和胞内钙离子释放，而胞内钙离子浓度增加会使钙蛋白酶过度激活，刺激炎症因子释放，进一步损伤肌细胞再生过程。
4其他相关研究
4.1人造肌肉
人造肌肉有望修复肌营养不良患者的肌肉萎缩，Fuoco等[18]的研究旨在通过人造肌肉治疗肌营养不良患者的肌肉萎缩，该研究将肌肉前体细胞mesoangioblasts置于聚酯纤维蛋白凝胶上进行培养，后将在实验室中培养的人造肌肉整合到肌肉萎缩症小鼠的腿部，经遗传工程改造的mesoangioblasts肌肉前体细胞即可产生生长因子，促使细胞周围产生神经组织和血管，在模型小鼠体内嫁接的人造肌肉具有和正常肌肉相似的外形和功能，可替代受损的肌肉。但由于小鼠的肌肉较少，该项研究进入临床尚需做更多研究。
4.2JAG1基因
Vieira等[19]在两只症状轻微的肌营养不良模型犬(与人类肌肉萎缩症同源)中发现了高度表达的JAG1基因，该基因在完全不修正突变基因的情况下，改善了模型犬的肌营养不良症状，大幅延长了生存期。在斑马鱼中进行的进一步试验发现，经过治疗的斑马鱼活动明显更多，肌肉形态更好，提示JAG1基因表达增强对肌肉萎缩症的临床症状具有缓解作用。JAG1基因过表达改善肌肉萎缩症临床表型的作用机制可能与JAG1/Notch信号通路有关，JAG1是Notch跨膜蛋白的配体，这一通路与肌肉损伤后的修复密切相关。但既往也有研究表明，外源性的JAG1可抑制Notch信号通路，因此只有通过其他小分子药物或基因治疗增强内源性JAG1基因的表达，才有望达到治疗目的。
4.3P2RX7嘌呤受体
P2RX7嘌呤受体为一类与肌肉萎缩症相关的重要靶标，Sinadinos等[20]的研究发现敲除肌肉萎缩症小鼠P2RX7基因，可使模型小鼠的症状得到缓解。敲除P2RX7基因4周龄的模型小鼠肌肉组织中，部分关键功能和分子参数显著改善，如肌肉结构改良、肌肉强度加大、肌肉炎症降低等。此外，小鼠血清肌酸激酶水平显著降低，认知功能损伤得到修复，骨质结构显著改善，在腿部肌肉、膈肌和心肌中，炎症减轻和肌纤维增生可持续到20个月。上述研究还表明，症状的改善与受体敲除的程度成正比，P2RX7拮抗剂的使用可进一步提高疗效，且未见明显不良反应。该项研究为肌肉萎缩症的治疗提供了新方向，也是人类攻克肌肉萎缩症过程中一个具有里程碑意义的发现。
4.4修复蛋白激活
修复蛋白的激活有助于肌肉萎缩症患者肌肉细胞的生产，Dysferlin蛋白是修复破损肌肉细胞膜的重要蛋白质。当肌肉细胞膜遭到破坏时，修复蛋白质Dysferlin被激活促进肌肉细胞膜的生成。如Dysferlin蛋白缺失，受伤的肌肉细胞膜即无法修复，骨骼肌细胞逐渐损失最终导致肌肉萎缩。Azakir等[21]的研究也证实，蛋白酶体抑制剂可激活肌肉萎缩症患者肌肉细胞中发生突变的Dysferlin蛋白，大量蛋白酶体抑制剂可使变异的修复蛋白功能恢复。
5结语
近些年，针对肌肉萎缩症治疗的研究不断取得进展，新的治疗策略和方法层出不穷，此前极具前景的治疗策略也在后续的研究中得到重新论证。然而，目前针对肌肉萎缩症的治疗策略尚无定论，仍需进一步的研究。
作者简介：马淑梅，博士研究生，助理研究员，研究方向：分子药理与
心血管药理的相关研究。
通信作者：刘莉，研究员，博士生导师，研究方向：药理学研究和新药
评价，擅长中药药理、免疫药理、消化药理领域化合物成药性、药理学
研究及评价。
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