肌营养不良治疗用葡萄糖你见过吗

Duchenne型肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy，DMD）是儿童中最常见的类型，患者由于持续性肌肉退化和萎缩，通常20岁左右便会死亡，直到今天，对这一疾病人们仍未有很好的治疗方案。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《NatureCommunications》上的题为《Hexoseenhancesoligonucleotidedeliveryandexonskippingindystrophin-deficientmdxmice》的最新研究论文，研究结果为探寻有效的DMD治疗策略提供了新思路。文中的腺相关病毒（AAV）包装由和元生物提供。

肌肉萎缩疾病是困扰人类多年的一类重大疾病，主要表现为肌肉营养不良，难以行动，代谢紊乱，许多病人寿命很短。在多种肌肉萎缩症中，DMD是最为凶险的一种，骨骼和肌肉发育畸形，随着病情的进展，病变会波及心脏和呼吸系统，最终造成患者心功能紊乱或呼吸衰竭而导致死亡。DMD的发生原因在于dystrophin基因发生了突变使机体缺乏dystrophin蛋白，后者是机体用于保持肌肉细胞膜完整性的重要蛋白质。基于DMD的发病频率和严重程度，其已成为医学研究的重要课题。目前对这一疾病尚无有效治疗方案，但反义寡核苷酸介导的外显子跳读是目前最有应用前景的治疗方法之一。己糖（hexose）是含有六个碳原子的单糖，是单糖中最重要的糖类，与机体的营养代谢关系最密切，常见的己糖有葡萄糖、甘露糖、果糖和山梨糖等。本期解读的就是天津医科大学尹海芳教授研究组发表在《NatureCommunications》上的题为《Hexoseenhancesoligonucleotidedeliveryandexonskippingindystrophin-deficientmdxmice》的最新研究论文，该文集中论述了使用己糖可以增强外显子跳读和寡核苷酸递送，为使用寡核苷酸治疗DMD提供了非常有价值的基础研究依据。

反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides,AO）技术是将短的DNA或RNA运送至靶组织，通过干扰RNA的加工过程从而达到调整基因表达的一种技术。近年来研究人员尝试将反义核苷酸技术应用到DMD的治疗上，纠正受到破坏的读码框，恢复正常dystrophin蛋白的表达。磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（phosphorodiamidatemorpholinooligomers，PMO）就是一种对DMD具有外显子跳跃治疗潜能的AO。小鼠静脉注射PMO后虽可有限增加骨骼肌中的dystrophin表达水平，但系统递送效率仍然有限。因此如何提高AO递送到肌肉细胞的效率及相应的安全性问题是该技术临床前应用研究的重点，也是解锁核酸疗法潜能、开发可广泛使用的高效递送技术的关键所在。目前临床输液中普遍使用的5%葡萄糖已被证明可以改善静脉注射的小干扰RNA-外泌体、小干扰RNA-肽复合体的稳定性。而目前尚不明确血糖浓度的升高对AO递送治疗DMD的影响。

动物模型的选取：

本文选取的mdx小鼠是目前研究肌营养不良的经典模型，与DMD患者一样，mdx小鼠骨骼肌细胞膜上不表达dystrophin蛋白。mdx小鼠的组织学在早期是正常的，在3周左右出现肌细胞变性坏死，表现出肌无力症状，随着疾病发展,肌细胞再生占据主导地位，病情趋于平稳，无力症状得到改善。

1、PMO联合碳水化合物促进dystrophin缺陷小鼠表达dystrophin

首先mdx小鼠胫骨前肌肉联合注射PMO和5%葡萄糖后，与对照组相比，出现大量dystrophin阳性肌纤维，dystrophin蛋白表达水平显著增加。不仅是5%葡萄糖，其他己糖类如2.5%葡萄糖和2.5%果糖混合物（GF）、5%果糖、5%甘露糖分别与PMO联合使用均可产生类似结果。且不同的己糖类升高dystrophin蛋白水平的作用效果在不同肌群中显示出明显的差异性（如下图）。

2、PMO-GF可产生长时程治疗效应和功能改善

静脉注射较低剂量PMO-GF可明显增加除心脏以外的其他周围肌群中dystrophin阳性肌纤维数目，同时在大多数被检测肌肉组群中都检测到因外显子23跳跃产生的较短基因条带（如下图）。在PMO-GF组，股四头肌、腓肠肌和腹肌中的dystrophin蛋白可恢复到接近正常水平，特别是横隔膜肌肉中的升高水平达到8倍以上，并伴随dystrophin相关蛋白复合物（DAPC）发生重排、血浆肌酸磷酸激酶（CK）水平的降低。在PMO-GF治疗组，特别是治疗后期，抓力测试显示出明显的力量恢复，此外血浆众多生化指标均提示治疗未造成明显的肝肾损伤、血糖水平异常升高或者炎性细胞激活（如下图）。

3、核酸摄入增加需要激活GF转运

作者还比较了分离注射和同时注射后的PMO-GF组的效应差异，结果表明分离注射PMO和GF未见明显增强dystrophin阳性肌纤维和外显子跳跃的效应，所有外周肌群对PMO的摄取都显著增加，GF也可广泛促进其他多种核酸的摄取，而给予葡萄糖和GF转运体抑制剂可取消GF对PMO的增强作用（如下图）。

4、GF代谢促进核酸摄取

实验证明，如果用不能被代谢的类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）替代GF，则GF增强PMO的作用消失。这一结果强烈提示GF代谢而非共转运参与了PMO-GF的效应。为了证实这一假设，作者首先通过肌肉注射AAV-shRNA（病毒包装由和元生物提供）敲低肌肉磷酸果糖激酶1（MusclePhosphofructokinase-1，PFKm），引起同一肌肉中的ATP水平明显降低，然后再注射PMO-GF，结果提示干扰组肌肉中dystrophin表达显著降低。此外，mdx小鼠肌肉单独注射ATP合成酶抑制剂也会降低基础ATP水平，如果共同给予PMO-GF和ATP合成酶抑制剂，则可明显抑制外显子跳跃活性（如下图）。

5、GF补充细胞能量储备

同时给予ATP和PMO，两者作用未出现叠加，说明两者是通过同一途径发挥作用。与对照组相比，mdx小鼠中骨骼肌ATP产生明显减少，注射PMO-GF可使肌肉ATP水平部分恢复。细胞能量补充促进肌肉摄取PMO的通路还在成肌细胞C2C12中进行了验证，clathrin依赖和非依赖性机制都参与了胞吞摄取PMO的过程。成肌细胞C2C12饥饿6小时模拟小鼠肌肉能量缺乏状态，后给予GF可显著增加细胞内ATP水平，与此同时GF处理可明显增加饥饿细胞的PMO摄取。这些直接证据都支持在细胞处于能量缺乏状态时GF能增加PMO的摄取（如下图）。

本文通过联合使用PMO和不同种类己糖如5%葡萄糖和GF，观察了对PMO递送改善PMO治疗dystrophin缺馅小鼠的作用。反复联合给予PMO和GF可增加外显子跳跃并使dystrophin蛋白表达增加，这一作用是由于GF代谢生成的ATP促进肌肉摄取PMO增加引起的。本文阐述的碳水化合物参与寡核苷酸递送的概念将对MDM外显子跳跃治疗提供更为有效的治疗策略。

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